Técnica de la PCR
La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) es una técnica que permite amplificar fragmentos específicos de ADN a partir de cantidades muy pequeñas. Su objetivo es obtener millones de copias de un segmento de ADN para analizarlo, identificarlo o usarlo en estudios genéticos, diagnóstico de enfermedades o análisis forenses.
Primero, el ADN molde, que es la secuencia de ADN que queremos amplificar. Luego, los cebadores o primers, que son secuencias cortas de nucleótidos que se unen a los extremos del fragmento de ADN a copiar y proporcionan un punto de inicio para la síntesis. Los nucleótidos (dNTPs: dATP, dTTP, dCTP y dGTP) son las unidades que la ADN polimerasa utiliza para construir las nuevas cadenas de ADN. La ADN polimerasa, generalmente Taq polimerasa, es la enzima que sintetiza las nuevas hebras de ADN y debe ser termoestable para soportar las altas temperaturas de la PCR. El buffer de reacción mantiene el pH y las condiciones iónicas óptimas para la actividad de la enzima, incluyendo sales como Mg²⁺ que actúan como cofactores. Finalmente, el agua libre de nucleasas completa el volumen de la reacción y asegura que todos los reactivos estén en la concentración adecuada.
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Desnaturalización (denaturation):
Se calienta la mezcla de reacción a ~ 94‑98 °C para separar las dos hebras de la molécula de ADN bicatenario, dejando hebras simples que servirán de plantilla. -
Hibridación (annealing):
Se baja la temperatura (normalmente 50‑65 °C, según la composición de los cebadores) para que éstos se unan (hibriden) a sus secuencias complementarias en el ADN molde. Esa unión marca los puntos de inicio para la síntesis. -
Extensión (extension):
Se sube la temperatura a ~ 72 °C (óptima para la Taq polimerasa). La enzima añade nucleótidos complementarios desde los cebadores, sintetizando nuevas hebras de ADN.
Estos tres pasos constituyen un ciclo. Al repetir ese ciclo típicamente entre 20 y 40 veces, el fragmento objetivo se duplica en cada ciclo, generando una amplificación exponencial del ADN.
Algunas versiones incluyen pasos extra:
-Desnaturalización inicial prolongada: para asegurar que todo el ADN molde esté separado al inicio.
-Extensión final tras los ciclos: para completar la síntesis de posibles hebras incompletas.
La interpretación de una prueba por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) consiste en analizar si el fragmento de ADN que se buscaba ha sido amplificado correctamente. Esto permite determinar si la secuencia de interés está presente o ausente en la muestra.
Para ello, los productos de la PCR se someten normalmente a una Electroforesis en gel de agarosa, donde las moléculas de ADN migran a través de un gel bajo corriente eléctrica y se separan según su tamaño. Si aparece una banda visible en la posición esperada (comparándola con un marcador de peso molecular conocido), se considera que la amplificación ha funcionado; la ausencia de banda indica que la secuencia no fue amplificada o no estaba presente.
Existen variantes más modernas, como la PCR en tiempo real (qPCR), que permite monitorear la amplificación durante el experimento mediante sondas o colorantes fluorescentes; así se puede cuantificar la cantidad de ADN amplificado en cada ciclo, lo que aporta información no solo sobre presencia/ausencia, sino sobre la abundancia del objetivo.
Además, cuando se secuencia el ADN amplificado, se pueden identificar mutaciones o variantes genéticas, lo que añade un nivel extra de información: no sólo que la secuencia existe, sino cómo es su estructura genética.
Conceptos relacionados:
1. Cebador (primer o sonda)
Un cebador es un pequeño fragmento de ADN sintético que se une a una zona concreta del ADN que se quiere amplificar. Sirve como punto de inicio para que la polimerasa pueda copiar la secuencia. Cuando se usa una sonda, además de unirse a la secuencia, lleva un marcador que permite detectar la amplificación.
2. Hibridación de los ácidos nucleicos
La hibridación es el proceso por el cual dos cadenas de ADN o ARN con secuencias complementarias se unen entre sí. En PCR, ocurre cuando los cebadores se “pegan” al ADN molde durante la fase de alineamiento.
3. ADN polimerasa (Taq polimerasa)
La ADN polimerasa es la enzima que copia la secuencia de ADN formando nuevas cadenas. En la PCR se usa una polimerasa resistente al calor llamada Taq polimerasa, procedente de una bacteria termófila, capaz de trabajar a temperaturas muy altas sin desnaturalizarse.
4. Desnaturalización del ADN
La desnaturalización es la separación de las dos hebras de la molécula de ADN cuando se calienta a alta temperatura (aprox. 94–95 ºC). Es el primer paso de cada ciclo de PCR y permite que los cebadores puedan unirse después.
5. Separación de los fragmentos por electroforesis
La electroforesis en gel es una técnica en la que el ADN amplificado se introduce en un gel y se aplica corriente eléctrica. Los fragmentos se desplazan según su tamaño, formando bandas que permiten comprobar si la PCR ha funcionado y cuál es la longitud del producto obtenido.
6. Marcador de peso molecular
El marcador de peso molecular es una mezcla de fragmentos de ADN de tamaños conocidos. Se coloca en el gel junto a las muestras para comparar las bandas y determinar el tamaño exacto del ADN amplificado.
La PCR tiene bastantes usos en investigación, medicina, biología, forense y diagnóstico, entre otros. Entre sus aplicaciones más comunes se encuentran:
-Diagnóstico de enfermedades infecciosas: detección de ADN/ARN de virus, bacterias u otros patógenos en muestras de pacientes.
-Diagnóstico de enfermedades genéticas: mediante la amplificación y análisis de genes específicos para detectar mutaciones o variaciones genéticas.
-Biología forense: generación de perfiles genéticos a partir de muestras mínimas (huesos, saliva, sangre).
-Investigación genética y biotecnología: clonación de genes, producción de ADN recombinante, estudios de genética molecular, expresión de genes, etc.
-Estudios de biodiversidad, evolución, conservación: amplificar ADN antiguo, ADN ambiental, secuencias de especies distintas.
-Medicina personalizada, oncología, genética molecular clínica: detección de mutaciones, análisis de tumores, diagnóstico prenatal.